Metformin kimyasal olarak biguanidlere aittir. Eylem ilkeleri hala tam olarak açıklığa kavuşturulmamıştır. Metforminin etkisi muhtemelen üç mekanizmaya dayanır: bir yandan karaciğerde glikoz oluşumunu (glukoneogenez) engeller. Deneysel çalışmalar, metforminin mitokondriyal gliserol-3-fosfat dehidrojenazı inhibe ettiğini göstermiştir. Sonuç olarak, yeni glikoz oluşumu için sitozolde daha az metabolit bulunur (ayrıca bkz. gliserol-3-fosfat mekiği) ve daha fazla laktat üretilir. Doz aşımı durumunda lakta asidozunun nadir görülen yan etkisi bununla açıklanabilir. Şekerin (glikoz) gıda ile emilimine ek olarak, glikozun amino asitlerin ve diğer metabolik ürünlerin dönüşümünden elde edildiği bu metabolik yol, kan şekeri seviyelerini etkileyen önemli bir faktördür. Ek olarak, metforminin bağırsaktaki glikoz emilimini engellediği ve ayrıca insülin direncini azalttığı, böylece kas hücrelerine emilimi iyileştirdiği söylenir. Bununla birlikte, her iki etki de henüz kesin olarak kanıtlanmamıştır.
Ayrıca, solunum zincirinin I kompleksinin de metforminin bir saldırı noktası olduğu bilinmektedir. Mekanizma, mitokondri tarafından biriken elektriksel membran potansiyeli nedeniyle, pozitif yüklü iyonların (fizyolojik pH değerindeki metformin gibi) mitokondride birikmesinin kolay olduğu gerçeğine dayanmaktadır. HepG2 hücrelerinde metformin için IC50 değeri 330 µM’dir. Son EM çalışmaları, metforminin birincil inhibitör bölgesinin kompleks I’in ubikinon bağlanma kanalında olduğunu, başka bir bağlanma bölgesinin ise ND5 alt biriminde bulunduğunu göstermektedir. Metforminin kompleks I üzerindeki inhibitör etkisi, antidiyabetik etkiyi ve metforminin tetiklediği ılımlı kilo kaybını da açıklayabilir.