İlk intein, 1988 yılında Neurospora crassa ve havuç vakuoler ATPaz (inteinsiz) ile ilk olarak varsayımsal bir kalsiyum iyon taşıyıcısı olarak tanımlanan mayadaki homolog gen (inteinli) arasındaki dizi karşılaştırması yoluyla keşfedilmiştir . 1990 yılında Hirata ve ark., maya genindeki ekstra dizinin mRNA’ya transkribe edildiğini ve ancak translasyondan sonra konak proteininden çıkarıldığını göstermiştir. O zamandan beri inteinler, yaşamın üç alanında ( ökaryotlar , bakteriler ve arkeler ) ve virüslerde bulunmuştur .
Protein birleştirme beklenmedik bir olaydı ve mekanizmaları 1990 yılında iki grup (Anraku ve Stevens ) tarafından keşfedildi. Her ikisi de bir vakuoler H + -ATPaz enziminin öncülünde bir Saccharomyces cerevisiae VMA1 keşfetti. N- ve C-terminallerinin amino asit dizisi, diğer organizmalardan bir vakuoler H + -ATPaz’ın DNA dizisinin %70’ine karşılık gelirken , merkezi pozisyonun amino asit dizisi, maya HO nükleazının toplam DNA dizisinin %30’una karşılık geliyordu .
Birçok gen, farklı pozisyonlara yerleştirilmiş, birbiriyle ilişkisiz intein kodlayan segmentlere sahiptir. Bu ve diğer nedenlerden dolayı, inteinler (veya daha doğru bir ifadeyle, inteinleri kodlayan gen segmentleri) bazen bencil genetik elementler olarak adlandırılır, ancak onlara parazitik demek daha doğru olabilir . Evrimin gen merkezli görüşüne göre, çoğu gen yalnızca diğer genler veya alellerle rekabet etmek için “bencil”dir , ancak genellikle organizmalar için bir işlevi yerine getirirler; oysa “parazitik genetik elementler”, en azından başlangıçta, organizmanın uygunluğuna olumlu bir katkıda bulunmazlar.
Aralık 2019 itibarıyla, UniProtKB veritabanı, yalnızca onlarca amino asit kalıntısından binlercesine kadar değişen, manuel olarak intein olarak etiketlenmiş 188 girdi içermektedir. İlk intein, Saccharomyces cerevisiae’nin VMA geninde kodlanmış olarak bulunmuştur . Daha sonra mantarlarda ( ascomycetes , basidiomycetes , zygomycetes ve chytridler ) ve çeşitli proteinlerde de bulunmuşlardır . Bilinen intein içeren proteine uzaktan benzeyen, ancak metazoan kirpi proteinlerine yakından benzeyen bir proteinin, Glomeromycota’dan intein dizisine sahip olduğu tanımlanmıştır . Yeni tanımlanan inteinlerin çoğu, homing endonükleazlar içerir ve bunlardan bazılarının aktif olduğu görülmektedir. Mantarlardaki intein bolluğu, intein içeren genlerin yatay transferini göstermektedir . Öbakterilerde ve arkelerde ise şu anda bilinen 289 ve 182 intein bulunmaktadır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, öbakterilerde ve arkelerde bulunan inteinlerin çoğu, mantarlar gibi nükleik asit metabolik proteinine yerleştirilmiş olarak bulunur.
İnteinler büyük ölçüde çeşitlilik gösterir, ancak aynı intein içeren proteinlerin birçoğu birçok türde bulunur. Örneğin, splaysomda önemli rol oynayan pre-mRNA işleme faktörü 8 (Prp8) proteini, ökaryotik türler arasında yedi farklı intein yerleştirme bölgesine sahiptir. İntein içeren Prp8 en yaygın olarak mantarlarda bulunur, ancak Amoebozoa , Chlorophyta , Capsaspora ve Choanoflagellida’da da görülür . Birçok mikobakteri, DnaB (bakteriyel replikatif helikaz), RecA (bakteriyel DNA rekombinaz) ve SufB ( FeS küme montaj proteini) içinde inteinler içerir . Hem mikobakteri cinsi içinde hem de ötesinde DnaB inteinlerinin yapısı ve sayısı bakımından dikkat çekici bir çeşitlilik vardır. İlginç bir şekilde, intein içeren DnaB, alglerin kloroplastlarında da bulunur . Arkelerde bulunan intein içeren proteinler arasında RadA (RecA homologu), RFC, PolB, RNR bulunur. Aynı intein içeren proteinlerin (veya homologlarının) birçoğu yaşamın iki hatta üç alanında da bulunur. İnteinler ayrıca bakteriyofajlar ve ökaryotik virüsler tarafından kodlanan proteomlarda da görülür . Virüsler, intein içeren organizmaların geniş çeşitliliğinde intein dağılımının vektörleri olarak rol oynamış olabilir.
Mekanizma
Bu bölümde Korunmuş A, B, F, G blokları hakkında bilgi eksik . Lütfen bu bilgileri içerecek şekilde bölümü genişletin. Daha fazla ayrıntı tartışma sayfasında bulunabilir . ( Kasım 2023 )
Sınıf 1 inteinler için süreç, öncü proteinin intein kısmının ilk kalıntısının ( serin , treonin veya sistein ) yan zincirinin , hemen yukarıdaki kalıntının (yani N-eksteinin son kalıntısının) peptit bağına nükleofilik olarak saldırmasıyla başlayan bir NO veya NS kaymasıyla devam eder ve doğrusal bir ester (veya tiyoester ) ara ürünü oluşturur. C-eksteinin ilk kalıntısının yan zinciri, yeni oluşan (tiyo)estere saldırdığında bir transesterifikasyon meydana gelir ve inteinin N-terminal ucunu serbest bırakır. Bu, N-ekstein ve C-eksteinin, peptit bağı yoluyla olmasa da, birbirine bağlı olduğu dallanmış bir ara ürün oluşturur. İnteinin son kalıntısı her zaman bir asparagindir (Asn) ve bu yan zincirin amid azot atomu, intein ve C-ekstein arasındaki peptit bağını kopararak, terminal siklik imide sahip serbest bir intein segmenti oluşturur . Son olarak, C-eksteinin serbest amino grubu artık N- ve C-eksteinleri birbirine bağlayan (tiyo)estere saldırır. Bir ON veya SN kayması bir peptit bağı ve işlevsel, bağlanmış protein üretir.
Sınıf 2 inteinlerin nükleofilik ilk yan zinciri yoktur, sadece bir alanin vardır. Bunun yerine, reaksiyon doğrudan nükleofilik bir yer değiştirme ile başlar; C-eksteinin ilk kalıntısı, N-eksteinin son kalıntısındaki peptit karboksiline saldırır. Geri kalanı her zamanki gibi devam eder, Asn’nin siklik imide dönüşmesiyle başlar.
Sınıf 3 inteinlerin nükleofilik ilk yan zinciri yoktur, sadece bir alanin vardır, ancak içlerinde bitişik olmayan bir “WCT” motifi bulunur. İç C (sistein) kalıntısı, N-eksteinin son kalıntısındaki peptit karboksiline saldırır (nükleofilik yer değiştirme). C-eksteinin ilk kalıntısı yeni oluşan tiyoestere saldırdığında transesterifikasyon meydana gelir. Geri kalanı her zamanki gibi ilerler.
Eklemleme etkisinin mekanizması, doğal kimyasal ligasyon adı verilen, orta büyüklükteki proteinlerin kimyasal olarak üretilmesi tekniğine doğal olarak oluşan bir benzerlik göstermektedir .
İntein
Bir intein, protein birleştirme sırasında kendisini çıkarabilen ve kalan kısımları ( eksteinleri ) bir peptit bağıyla birleştirebilen bir protein segmentidir . İnteinlere, (RNA) intronlarına benzetilerek protein intronları da denilmiştir .
İntein eklenmesi, translasyon sonrası kendi kendine katalitik bir süreçte gerçekleşir. Burada ekstein kırmızı, intein ise mavi renkte gösterilmiştir.
Adlandırma kuralları
Bir intein adının ilk kısmı, bulunduğu organizmanın bilimsel adına, ikinci kısmı ise karşılık gelen gen veya eksteinin adına dayanır. Örneğin, Thermoplasma acidophilum’da bulunan ve Vacuolar ATPase alt birimi A (VMA) ile ilişkili intein ” Tac VMA ” olarak adlandırılır.
Normalde, bu örnekte olduğu gibi, organizmayı belirtmek için sadece üç harf yeterlidir, ancak varyasyonlar da vardır. Örneğin, bir suşu belirtmek için ek harfler eklenebilir. İlgili gen içinde birden fazla intein kodlanmışsa, inteinlere 5’ten 3’e kadar veya tanımlanma sırasına göre sayısal bir sonek verilir ( örneğin , “Msm dnaB-1”) .
İnteini kodlayan gen segmentine genellikle intein ile aynı isim verilir, ancak karışıklığı önlemek için inteinin asıl adı genellikle büyük harfle yazılır ( örneğin , Pfu RIR1-1), buna karşılık gelen gen segmentinin adı ise italik yazılır ( örneğin , Pfu rir1-1 ). Farklı bir ayırt edici kural ise kaynak protein adının sonuna küçük harf “i” koymaktır, örneğin “Msm DnaBi1”.
İntein türleri
İnteinler birçok kritere göre sınıflandırılabilir.
Kendilerini nasıl ayırdıklarına bağlı olarak, cis-ayrılma (yani kendilerini ayırırlar) veya trans-ayrılma (yani dışarıdan yardıma ihtiyaç duyarlar) olarak sınıflandırılabilirler . İncelenen inteinlerin çoğu cis-ayrılma özelliğine sahiptir. Bölünmüş inteinler (aşağıya bakınız) genellikle iki yarımın birbirine yardım etmesini içerir, bu nedenle trans-ayrılma özelliğine sahiptirler .
İçerdikleri endonükleaz alanına bağlı olarak. Endonükleaz alanına sahip olanlara “maksi-intein”, aksi takdirde “mini-intein” denir.
Kısmen diziye göre çıkarılabilen ekleme mekanizmalarına dayanarak . Sınıf 1 intein en çok incelenen tiptir ve ilk kalıntı olarak sistein veya serin ile işaretlenir. Sınıf 2 intein veya “alanin intein”, ilk kalıntı olarak alanin içerir ve WCT motifi içermez. Sınıf 3 intein, ilk kalıntı olarak alanin içerir ve bitişik olmayan bir “WCT” motifi içerir. Ayrıca, serin ile başlayan ve “WCT” motifi içeren inteinlerin de sınıf 3 olarak sınıflandırılması önerilmiştir.
Tam ve mini bağırsaklar
İnteinler, ekleme alanlarına ek olarak bir homing endonükleaz geni (HEG) alanı içerebilir . Bu alan , homolog kromozomdaki intein içermeyen bir allelde DNA’yı keserek inteinin yayılmasından sorumludur ve DNA çift sarmallı kırılma onarımı (DSBR) sistemini tetikler ; bu sistem daha sonra kırılmayı onarır ve böylece intein kodlayan DNA’yı daha önce intein içermeyen bir bölgeye kopyalar. HEG alanı intein eklemesi için gerekli değildir ve bu nedenle kaybolabilir, minimal veya mini bir intein oluşturabilir. Birkaç çalışma , HEG alanlarını ekleyerek veya çıkararak ve yeni yapının aktivitesini belirleyerek inteinlerin modüler doğasını göstermiştir.
Bölünmüş bağırsaklar
Bazen öncü proteinin inteini iki genden gelir. Bu durumda inteine bölünmüş intein denir . Örneğin, siyanobakterilerde , DNA polimeraz III’ün katalitik alt birimi α olan DnaE , dnaE-n ve dnaE-c olmak üzere iki ayrı gen tarafından kodlanır . dnaE-n ürünü, 123 amino asitlik bir intein dizisini takip eden bir N-ekstein dizisinden oluşurken, dnaE-c ürünü 36 amino asitlik bir intein dizisini takip eden bir C-ekstein dizisinden oluşur.
Biyoteknolojideki uygulamalar
İnteinler protein birleştirmede çok etkilidir ve buna bağlı olarak biyoteknolojide önemli bir rol bulmuşlardır . Bugüne kadar 200’den fazla intein tanımlanmıştır; boyutları 100 – 800 AA arasında değişmektedir. İnteinler, protein yarı sentezi ve büyük proteinlerin NMR çalışmaları için yararlı olan protein segmentlerinin seçici etiketlenmesi gibi belirli uygulamalar için tasarlanmıştır .
İntein ayrışmasının farmakolojik olarak engellenmesi , ilaç geliştirme için faydalı bir araç olabilir ; intein ayrışmazsa, inteini içeren protein normal işlevini yerine getiremez, çünkü yapısı bozulacaktır.
İnteinlerin , örneğin gen terapisinde , mitokondriyal genom tarafından normalde kodlanan bazı yüksek derecede hidrofobik proteinlerin allotopik ekspresyonunun sağlanmasında yararlı olabileceği öne sürülmüştür . Bu proteinlerin hidrofobikliği, mitokondriye ithalatlarına engel teşkil etmektedir. Bu nedenle, hidrofobik olmayan bir inteinin eklenmesi, bu ithalatın devam etmesine olanak sağlayabilir. İthalattan sonra inteinin çıkarılması, proteini vahşi tipe geri döndürecektir .
Afinite etiketleri, rekombinant proteinlerin az miktarda safsızlıkla birikmesine olanak sağladığı için rekombinant proteinlerin saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, afinite etiketi son saflaştırma adımında proteazlar tarafından çıkarılmalıdır. Ek proteoliz adımı, rekombinant proteinden afinite etiketlerinin çıkarılmasında proteaz özgüllüğü ve sindirim ürününün çıkarılması sorunlarını ortaya çıkarır. Bu sorun, kontrollü bir ortamda afinite etiketinin kendi kendine parçalanabilen inteinlere kaynaştırılmasıyla önlenebilir. Bu türün ilk nesil ekspresyon vektörleri, modifiye edilmiş Saccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA) inteinini kullanmıştır. Chong ve ark. , Bacillus circulans’tan bir kitin bağlama alanı (CBD) afinite etiketi olarak kullanmış ve bu etiketi modifiye edilmiş bir Sce VMA inteinine kaynaştırmıştır. Modifiye edilmiş intein, geniş bir pH aralığında düşük sıcaklıklarda 1,4-ditiyotreitol (DTT), β-merkaptoetanol (β-ME) veya sistin ile N-terminal peptit bağlantısında kendi kendine parçalanma reaksiyonuna girer . Rekombinant protein ifade edildikten sonra, hücre homojenatı kitin içeren kolondan geçirilir . Bu, kimerik proteinin CBD’sinin kolona bağlanmasına olanak tanır. Dahası, sıcaklık düşürüldüğünde ve yukarıda açıklanan moleküller kolondan geçtiğinde, kimerik protein kendi kendine birleşmeye uğrar ve yalnızca hedef protein elüe edilir. Bu yeni teknik, proteoliz adımına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve modifiye edilmiş Sce VMA, CBD aracılığıyla kitine bağlı olarak kolonda kalır.
Son zamanlarda, kendi kendine kümelenen peptitlere dayalı proteinlerin saflaştırılması için inteinler kullanılmıştır. Elastin benzeri polipeptitler (ELP’ler) biyoteknolojide faydalı bir araçtır. Hedef proteinle birleştirildiklerinde, hücrelerin içinde kümeler oluşturma eğilimindedirler. Bu, protein saflaştırmasında gerekli olan kromatografik adımı ortadan kaldırır. ELP etiketleri, intein füzyon proteininde kullanılmıştır, böylece kümeler kromatografi olmadan (santrifüjleme yoluyla) izole edilebilir ve daha sonra intein ve etiket, hedef proteini çözeltiye salmak için kontrollü bir şekilde parçalanabilir. Bu protein izolasyonu, sürekli ortam akışı kullanılarak yapılabilir ve yüksek miktarda protein elde edilmesini sağlayarak bu süreci geleneksel yöntemlerden daha ekonomik hale getirir. Başka bir araştırma grubu, hedef proteini izole etmek için daha küçük kendi kendine kümelenen etiketler kullandı. Küçük amfipatik peptitler 18A ve ELK16 (şekil 5), kendi kendine parçalanan kümelenen protein oluşturmak için kullanıldı.
Antimikrobiyal geliştirme alanındaki uygulamalar
Son yirmi yılda, antimikrobiyal uygulamalar için inteinlerden yararlanmaya yönelik ilgi artmıştır . İntein eklemesi yalnızca tek hücreli organizmalarda bulunur ve özellikle patojenik mikroorganizmalarda oldukça yüksektir. Dahası, inteinler genellikle temel proteinlerde ve/veya organizmanın insan konakçısı içinde hayatta kalmasında rol oynayan proteinlerde bulunur. Proteinlerin düzgün bir şekilde katlanması ve işlev görmesi için translasyon sonrası intein çıkarılması gereklidir. Örneğin, Gaëlle Huet ve arkadaşları, Mycobacterium tuberculosis’te eklenmemiş SufB’nin SUF mekanizmasının bir bileşeni olan SufBCD kompleksinin oluşumunu engellediğini göstermiştir .Bu nedenle, intein eklemesinin inhibisyonu, antimikrobiyallerin geliştirilmesi için güçlü bir platform görevi görebilir.
İntein ekleme inhibitörleri üzerine yapılan güncel araştırmalar, antimikobakteriyellerin ( M. tb.’nin üç intein içeren proteini vardır) yanı sıra patojenik mantarlar Cryptococcus ve Aspergillus’a karşı aktif ajanların geliştirilmesine odaklanmıştır . Sisplatin ve benzeri platin içeren bileşikler, katalitik kalıntılara bağlanarak M. tb. RecA inteininin eklenmesini engeller. Bakır (II) ve çinko (II) iyonları gibi iki değerlikli katyonlar, eklemeyi tersine çevrilebilir şekilde engellemek için benzer şekilde işlev görür.
Bununla birlikte, bu yöntemlerin hiçbiri şu anda etkili ve güvenli bir antibiyotik için uygun değildir. Mantar Prp8 inteini de iki değerlikli katyonlar ve sisplatin tarafından katalitik Cys1 kalıntısına müdahale edilerek inhibe edilir. 2021 yılında Li ve ark. Prp8 intein eklemesinin küçük molekül inhibitörlerinin C. neoformans ve C. gattii’nin büyümesini yavaşlatmada seçici ve etkili olduğunu gösterdi ve intein ekleme inhibitörlerinin antimikrobiyal potansiyeli için heyecan verici kanıtlar sağladı.