Amikasin , 16S rRNA’ya ve prokaryotik ribozomun 30S alt biriminin RNA bağlayıcı S12 proteinine geri dönüşümsüz olarak bağlanır ve ribozomun şeklini değiştirerek protein sentezini engeller, böylece mRNA kodonlarını doğru bir şekilde okuyamaz. Ayrıca tRNA antikodonunun oynak tabanıyla etkileşime giren bölgeye de müdahale eder. Konsantrasyona bağlı bir şekilde çalışır ve alkali bir ortamda daha iyi etki gösterir.