Azatioprin, dokular içinde 6-MP’ye dönüştürülür ve bunun bir kısmı da bir amino grubunun eklenmesiyle 6-tiyoguanine dönüştürülür. Hem 6-MP hem de 6-tiyoguanin, riboz ile konjuge edilir ve daha sonra sırasıyla tiyoinosinik asit ve tiyoguanilik asit nükleotidlerini oluşturmak üzere fosforile edilir .
Bu nükleotidler sırasıyla inosinik asit ve guanilik asit gibi davranır ; ilki purin nükleotid biyosentezinin başlangıç noktasıdır, ikincisi ise DNA ve RNA’nın yapı taşlarından biridir.
Nükleotidler yeni sentezlenen (ancak işlevsiz) DNA’ya dahil olur ve replikasyonu durdurur .
Nükleotidler, DNA ve RNA sentezindeki daha erken adımlardan biri olan purin biyosentezinde yer alan enzimlerden biri olan glutamin -fosforibozil pirofosfat amidotransferazı (GPAT) inhibe etmek için etki eder. Ürün inhibisyonu adı verilen bir negatif geri bildirim biçimiyle GPAT inhibisyonuna ulaşırlar . Aktif olarak çoğalan hücreler (kanser hücreleri ve bağışıklık sisteminin T hücreleri ve B hücreleri gibi ) purin sentezlemede ve yeni DNA yapmada en aktif olduklarından, bu hücreler en güçlü şekilde etkilenirler.
Nükleotidlerin bir kısmı ayrıca trifosfat formlarına fosforile edilir. Bunlar GTP bağlayıcı protein Rac1’e bağlanarak Bcl-xL proteininin sentezini engeller ve böylece aktive olmuş T hücrelerini ve mononükleer hücreleri apoptoza (programlanmış hücre ölümü) gönderir. Mononükleer hücrelerin apoptozunda artış, azatioprin ile tedavi edilen inflamatuar bağırsak hastalığı hastalarında görülür.